Séquençage de Sanger

Le séquençage de l’ADN permet de déterminer l’ordre des nucléotides dans un brin d’ADN. Les quatre nucléotides de base sont l’adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C) et la thymine (T). Ces nucléotides sont les éléments chimiques constitutifs de l’ADN. L’ordre ou la séquence de ces éléments indique à vos cellules comment se comporter.

Au début des années 1980, les scientifiques ont découvert deux nucléotides dont les structures chimiques étaient légèrement modifiées. Aujourd’hui, on connaît quatre nucléotides modifiés. Ce sont la méthyladénine (mA) et trois variantes de la cytosine : la méthylcytosine (mC), la 5-formylcytosine et la 5-carboxylcytosine. Les chercheurs continuent d’étudier le rôle de ces nucléotides modifiés. À ce jour, on a découvert qu’ils jouent un rôle important dans l’activation et la désactivation des gènes. Par exemple, ils influencent l’inactivation du chromosome X.

Le savais-tu?

En 2019, une équipe de scientifiques dirigée par Shuichi Hoshika a ajouté quatre nucléotides synthétiques aux quatre nucléotides produits naturellement. Le résultat est un code génétique à huit lettres qu’on peut utiliser pour générer l’ADN hachimoji.

Au niveau de l’ADN, les humains sont identiques à 99,9 %. Le 0,1 % restant est ce qui rend chacun de nous unique! Il s’agit de caractéristiques comme la couleur des cheveux, le groupe sanguin… et le fait que tu aimes ou non le brocoli!

Le séquençage de l’ADN s’est avéré très important dans différents domaines, y compris la médecine, la biotechnologie et la criminalistique. Cette technologie peut aider les scientifiques à trouver les gènes impliqués dans les maladies et à développer des remèdes. Le séquençage de l’ADN peut également aider les scientifiques qui enquêtent sur des crimes. Ces professionnels se basent sur les preuves génétiques, comme les échantillons de cheveux ou de cellules cutanées.

Historique du séquençage de l’ADN

À la fin des années 1970, les scientifiques ont mis au point les deux premières méthodes de séquençage de l’ADN. Allan Maxam et Walter Gilbert ont développé le séquençage chimique, méthode également appelée séquençage de Maxam-Gilbert. Cette méthode s’appelle également le séquençage chimique. Elle se sert de produits chimiques pour diviser l’ADN en petits fragments afin de déterminer sa séquence. Cette méthode était révolutionnaire à l’époque. Cependant, elle est moins efficace que celles qu’on a élaborées plus récemment.

En 1977, Frederick Sanger et ses collègues ont conçu une autre méthode de séquençage de l’ADN. Pendant environ 40 ans, elle est demeurée la méthode la plus utilisée. Même si on a développé des méthodes plus rapides et moins coûteuses depuis, celle de Sanger est encore largement utilisée.

Le savais-tu?

Frederick Sanger a remporté le prix Nobel de chimie à deux reprises! L’un des prix a récompensé ses recherches sur la structure de l’insuline et l’autre, sa méthode de séquençage de l’ADN.

Le séquençage de Sanger repose sur le procédé de la réplication de l’ADN. Les scientifiques font des copies de brins d’ADN. Ensuite, ils notent les nucléotides ajoutés. Ainsi, ils peuvent observer la séquence des nucléotides.

Comment fonctionne le séquençage de Sanger?

D’abord, on extrait un fragment d’ADN de l’échantillon. Ensuite, on chauffe ce fragment. Ainsi, on force l’ADN à se dérouler. Les deux brins de la double hélice se séparent en brins individuels.

La prochaine étape consiste à abaisser la température et à ajouter une amorce d’ADN. Celle-ci est une courte séquence d’ADN à un seul brin. L’amorce d’ADN s’attache au brin d’ADN qu’on tente de séquencer. Elle indique le début du séquencement, un peu comme une ligne de départ.

Par la suite, on augmente légèrement la température. Puis, on ajoute des nucléotides libres et une enzyme appelée ADN polymérase. Les nucléotides libres contiennent l’une des quatre bases suivantes : cytosine, thymine, adénine ou guanine. En commençant par la séquence d’amorce, l’ADN polymérase construit un brin d’ADN complémentaire (ou inverse). Elle le fait en ajoutant un nucléotide à la fois.

Quatre réactions de séquençage différentes doivent se produire, une pour chacun des quatre types de nucléotides. Pour obtenir ces réactions, il faut ajouter au mélange des versions chimiquement modifiées de chacun des nucléotides. Ces versions indiquent la terminaison d’une chaîne. Chacun de ces nucléotides spéciaux est étiqueté avec un colorant différent. Ainsi, les scientifiques peuvent les voir lorsqu’ils les exposent aux rayons UV.

Lorsque l’ADN polymérase atteint un nucléotide de terminaison de chaîne, elle arrête la séquence d’ADN qu’elle était en train de construire. L’ADN polymérase ajoute les nucléotides modifiés de façon aléatoire. De nombreuses séquences d’ADN de différentes longueurs sont donc produites.

Ensuite, les segments d’ADN subissent l’électrophorèse en gel. Celle-ci permet de séparer les fragments d’ADN de différentes longueurs. Pour ce faire, on doit ajouter les fragments d’ADN à un excipient de gel, puis y faire passer un courant électrique. Cela fait en sorte que les segments s’alignent dans le gel en fonction de leur taille. Les petits fragments se déplacent davantage que les gros. Lorsque les fragments ont fini de se déplacer, on examine le gel à l’aide d’un appareil de radiographie ou d’une lumière UV. Ainsi, chaque segment devient visible.

On peut « lire » le gel en regardant les bandes foncées dans chaque colonne. Il y a une colonne pour chaque type de nucléotide (G, C, A, T). En examinant la séquence des bandes, on peut déterminer la séquence des nucléotides.

Les scientifiques ont modifié la méthode mise au point par Sanger. On utilise maintenant des fluorochromes. Ce sont de petits composés chimiques qui émettent une lumière colorée. On ajoute un fluorochrome de couleur différente à chaque nucléotide. Ainsi, on peut effectuer le séquençage en un seul mélange réactif dans un tube capillaire.

Pour déterminer la séquence, on éclaire le tube avec un laser. Lorsque la lumière traverse chaque bande de couleur, un détecteur inscrit un pic sur un graphique. Ces pics correspondent aux bases nucléotidiques. À l’aide des fluorochromes, les scientifiques peuvent automatiser le séquençage de l’ADN. Cela accélère le processus.

La méthode de Sanger a permis aux scientifiques de séquencer l’ADN de nombreux organismes, allant des bactéries aux humains. À l’aide de fluorochromes et d’un ordinateur, il est possible de séquencer l’ADN d’une personne (qui comprend trois milliards de bases) en l’espace de quelques jours. Par le passé, le même processus prenait des années!

Le savais-tu?

Les scientifiques doivent créer et utiliser des procédés spéciaux pour détecter les quatre nouveaux nucléotides modifiés. Ces recherches sont importantes parce que les modifications jouent un rôle dans le développement et dans les maladies comme le cancer.